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動物細胞培養及應用

時間:2017-10-21 16:45     作者:研發部 祝秀梅


動物細胞培養是指離散的動物活細胞在體外人工條件下的生長、增殖過程(在此過程中,細胞不再形成組織)。由于動物細胞培養是在人工條件下進行的,便于調控和觀察,因而成為現今研究動物的物質代謝過程、染色體的形態變化、以及遺傳物質的表達調控等高難領域的既便利而又有效的新方法。同時,隨著現代生物化學、分子生物學、分子遺傳學、以及現代醫學的發展,細胞培養也在許多應用領域充分展示了其巨大的發展潛力,并已為世人所關注。盡管如此,動物細胞培養仍是一門年輕的新學科,在發展之初就被混淆于動物組織培養之中。
      組織培養技術創建于18世紀末,之后美國生物學家Harrison于1907年在無菌條件下以淋巴液為培養基在試管中成功培養蛙胚神經組織后,才逐漸發展形成一種新的組織培養技術—動物細胞培養技術。該技術是把從體內組織提取的細胞,在無菌、適當溫度及酸堿度和一定營養條件下的模擬體內生存環境中,使其生長繁殖并維持其結構和功能。該實驗技術為細胞學、遺傳學、病毒學、免疫學的研究和應用做出了重要貢獻。特別是隨著近年來現代生物科學領域的迅速拓展,各種分子生物學實驗諸如核移植、細胞雜交、DNA介導的基因轉移等,都是借助細胞培養技術而得以實現的。
      近30年來,由于大規模細胞培養技術的研究和開發,以及一些有分泌能力的細胞所表現出的獨有的優越性,使動物細胞培養在生化藥品、遺傳病治療、以及癌癥的研究和治療上倍受人們的重視,并已開始走上產業化的道路。
1 動物細胞的培養方法
1.1 貼壁培養法
      貼壁培養(attachment culture)是指細胞貼附在一定的固相表面進行的培養。需要附著于帶適量電荷的固體或半固體表面才能生長,大多數動物細胞,包括非淋巴組織細胞和許多異倍體細胞均屬于這一類。其基本操作過程是:先將采集到的活體動物組織在無菌條件下采用物理(機械分散法)或化學(酶消化法)的方法分散成細胞懸液,經過濾、離心、純化、漂洗后接種到加有適宜培養液的培養皿(瓶、板)中,再放入二氧化碳培養箱進行培養。用此法培養的細胞生長良好且易于觀察,適于實驗室研究。但貼壁生長的細胞有接觸抑制的特性,一旦細胞形成單層,生長就會受到抑制,細胞產量有限。如要繼續培養,還需將已形成單層的細胞再分散,稀釋后重新接種,然后進行傳代培養。
貼壁培養的優點:①細胞緊密黏附于固相表面,可直接傾去舊培養液,清洗后直接加入新培養液,容易更換培養液。②因細胞固著于載體表面,不需過濾系統,容易采用灌注方式培養,從而達到提高細胞密度的目的;③當細胞貼壁于生長基質時,細胞將更有效的表達一種產品;④同一設備可培養多種細胞,并根據需要采用不同的培養液和細胞的比例。
      貼壁培養的缺點:①細胞增殖貼壁后不易消化下來,培養的擴大比較困難;②培養設施占地面積大,設備投資大;③采用細胞反應器培養,細胞無法進行顯微鏡觀察,不能有效監測細胞的生長狀態;④在測定和控制細胞所處環境的完全均勻化方面比較困難。
1.2 懸浮培養法
      懸浮培養(suspension culture)是指細胞在反應器中自由懸浮生長的過程,通過振蕩或轉動裝置使細胞始終處于分散懸浮于培養液內的培養方法。其是在微生物發酵的基礎上發展起來的,主要用于非貼壁依賴型細胞培養,如BHK- 21、雜交瘤細胞等。該法將采集到的活體動物組織分散、過濾、離心、純化、漂洗后接種到適宜的培養液中,并置于特定條件下進行自由懸浮培養。無血清懸浮培養是用已知人源或動物來源的蛋白或激素代替動物血清的一種細胞培養方式,它能減少后期純化工作,提高產品質量,正逐漸成為動物細胞大規模培養研究的新方向。
      懸浮培養的優點:①操作簡單、培養條件均一、便于進行定量研究;②傳質和傳氧比較好,有利于細胞與培養基中的營養物質和氣體充分接觸,而且易于控制培養條件(溫度、pH、氧分壓和CO2等);③它們在離體培養時不需要附著物,只需懸浮于培養液中就可以良好生長;④懸浮培養法細胞增殖快,產量高,設備結構簡單;⑤細胞傳代時不需要再分散,只需按比例稀釋即可繼續培養。可借鑒細菌發酵的經驗,容易擴大培養規模,可連續擴大生產量;⑥易于在連續密閉的系統中進行,減少了操作步驟和污染的機會。
懸浮培養的缺點:①細胞密度較低,較難采用灌流培養;② 轉化細胞懸浮培養有潛在致癌的危險,培養病毒易失去病毒標記而降低免疫能力。③適于懸浮培養的動物細胞種類很少,大多數動物細胞屬于貼壁依賴性的,因此不能懸浮培養。
1.3 固定化培養
      固定化培養(immobilization culture)是將動物細胞與水不溶性載體結合起來,再進行培養的一種方法。具有細胞生長密度高,抗剪切力和抗污染能力強等優點,細胞易于產物分開,有利于產物分離純化。培養方法很多,包括吸附法、包埋法、共價貼附法、微囊法、離子/ 共價交聯法等。
1.3.1 吸附法
      用固體吸附劑將細胞吸附在其表面而使細胞固定化的方法稱為吸附法(adhesion)。操作簡便、條件溫和、是動物細胞固定化中最早研究使用的方法。缺點是:載體的負荷能力低,細胞易脫落。微載體培養和中空纖維培養是該方法的代表。 
1.3.2 共價貼附法
      利用共價鍵將動物細胞與固相載體結合的固定化方法稱為共價貼附法(attachment by covalent bonding)。此法可減少細胞的泄漏,但須引入化學試劑,對細胞活性有影響,且因貼附而導致擴散限制小,細胞得不到保護。 
1.3.3 離子/共價交聯法
      雙功能試劑處理細胞懸浮液,會在細胞間形成橋而絮結產生交聯作用,此固定化細胞方法稱為離子/共價交聯法(cross-linking by covalent bonding)。交聯試劑會使一些細胞死亡,也會產生擴散限制。 
1.3.4 包埋法
      將細胞包埋在多孔載體內部制成固定化細胞的方法稱為包埋法(entrapment).優點是:步驟簡便、條件溫和、負荷量大、細胞泄漏少、抗機械剪切。缺點是:擴散限制,并非所有細胞都處于最佳基質濃度,且大分子基質不能滲透到高聚物網絡內部。一般適用于非貼壁依賴型細胞的固定化,常用載體為多孔凝膠,如瓊脂糖凝膠、海藻酸鈣凝膠和血纖維蛋白。 
1.3.5 微囊法(microencapsulation)
      是用一層親水的半透膜將細胞包圍在珠狀的微囊里,細胞不能逸出,但小分子物質及營養物質可自由出入半透膜;囊內是一種微小培養環境,與液體培養相似,能保護細胞少受損傷,故細胞生長好、密度高。
2 應用
2.1 在生物學基礎研究中的應用
      離體培養的動物細胞具有培養條件可人為控制且便于觀察檢測的特點,因而可廣泛應用于生物學領域的基礎研究中。在細胞生物學上,動物細胞培養可用于研究動物的正常或病理細胞的形態,生長發育,細胞營養,代謝以及病變等微觀過程。如神經細胞的增殖,突起生長、相互識別、刺激傳遞等機理就是通過進行各種神經細胞的培養才弄清楚的;在遺傳學研究中,除可用培養的動物細胞進行染色體分析外,還可結合細胞融合技術建立細胞遺傳學,進行遺傳分析和雜交育種;在胚胎工程中,通過體外培養卵母細胞、體外受精、胚胎分割和移植等技術的綜合應用,動物細胞離體培養已發展成了一種較成熟的技術而應用于家畜的繁殖生產中。另外,分離和培養具有多潛能性的胚胎干細胞,還可用于動物克隆、細胞誘導分化和動物育種的研究,并可作為基因轉移的高效表達載體;在病毒學研究中,用培養的動物細胞代替試驗動物做斑點分析,不僅方法簡便、準確、而且重復性好。
2.2 在臨床醫學上的應用
      首先,動物細胞培養技術可用于遺傳疾病和先天畸型的產前診斷。目前,人們已經能夠用羊膜穿刺技術獲得脫落于羊水中的胎兒細胞,經培養后進行染色體分析或甲胎蛋白檢測即可診斷出胎兒是否患有遺傳性疾病或先天畸型。以此可避免先天殘疾兒的誕生。現在用這種方法已能檢測出幾十種代謝性遺傳缺陷疾病和先天畸型疾病。
      其次,現在的一些科學研究已能通過染色體對比分析檢測出易患癌癥的病人,以便進行及早的預防和治療。在這方面,我國的科研工作者有著較為突出的研究成果,他們改進了淋巴細胞的培養方法,從而使帶有癌基因的人的染色體表現出明顯高于常人的畸變率,這就從細胞分子水平揭示了癌癥的病理、病因,并為癌癥的早期診斷和預防提供了科學依據。
      再次,細胞培養還可用于臨床治療。目前已有將正常骨髓細胞經大量培養后植入患造血障礙癥患者體內進行治療的報道。另外,動物細胞培養生產的生物大分子制品也可用于治療某些代謝缺陷疾病,如利用動物細胞培養生產的重組人促紅細胞生成素(rHuEPO)在臨床上可用于治療腎衰性貧血、癌癥患者化療后貧血,以及擇期手術者的自身輸血血液儲備都有極顯著的效果。
2.3 在動物育種上的應用
      目前,由于細胞培養技術、細胞融合技術、細胞雜交技術以及轉基因技術的創建與相互結合,使得人們能夠在細胞水平操作并改變動物的基因,進行遺傳物質的重組。這樣就可以按照人類的需要大幅度地改變生物的遺傳組成,從而使新品種的培育在實驗室中即可完成,可大大縮短育種進程,且使育種工作更加經濟有效。胚胎干細胞的研究成果和克隆羊多莉的問世可以說已為動物遺傳育種開辟了一條新途徑。
2.4 可用于生產大分子生物制品
      利用動物細胞大規模培養技術生產大分子生物制品始于上世紀60年代,當時是為了滿足生產FMD疫苗的需要。后來隨著大規模培養技術的逐漸成熟和轉基因技術的發展與應用,人們發現利用動物細胞大規模培養技術來生產大分子藥用蛋白比原核細胞表達系統更有優越性。因為,重組技術修飾過的動物細胞能夠正常地加工、折疊、糖基化、轉運、組裝和分泌由插入的外源基因所編碼的蛋白質,而細菌系統的表達產物則常以沒有活性的包涵體形式存在。隨著大量永久性細胞株的創建,在商業利益的驅動下,動物細胞大規模培養技術也迅速發展起來,并被付之于應用。如,用Vero細胞高密度培養工業化生產疫苗,以及hGH、UK、t-PA等蛋白藥物;用昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統生產安全可靠的生物殺蟲劑;用雞胚細胞生產雞法氏囊、新城疫、馬立克等多種疫苗;用轉基因技術克隆hEPO基因,并在GHO-DHFR細胞中表達,生產重組人促紅細胞生成素(rhPO)等。   
      目前,用動物細胞可生產的生物制品有各類疫苗、干擾素、激素、酶、生長因子、病毒殺蟲劑、單克隆抗體等,其銷售收入已占到世界生物技術產品的一半以上。如單抗,在美國1992年的年銷售額就達6億美元,預計1998年將達到40億美元。我們相信,隨著動物細胞培養技術的發展,以后還會有更多的生物制品被開發,并用于造福人類。
3 存在問題與展望
      體外動物細胞培養中銨離子、乳酸和CO2的積累對細胞產生毒性作用或者改變細胞代謝水平,抑制細胞生長,需要及時改善培養環境。細胞凋亡是大規模細胞培養過程的重要制約環節,用基因工程方法將bcl-2基因這種細胞凋亡抑制基因導入細胞,成為眾多研究者的選擇。 Bcl-2基因的過量表達能抑制Gln或氧缺乏引起的細胞凋亡,減少細胞特定營養成分的消耗,提高細胞密度和目的蛋白產量。培養基中所添加的血清主要來源于動物或人,但存在潛在的污染源、不同批間蛋白含量差異大及價格高等缺點。有些細胞株依賴于血清源性生長因子的特性可通過分子遺傳途徑予以改變,即導入特異生長因子的基因,使細胞能合成自身的生長因子來滿足細胞生長需要,而對細胞生長無副作用。另外,導入一些基因改變細胞生長周期的調控也可使細胞在無血清/蛋白的培養基中生長。只要在培養基中增加某些適于細胞生長的成分,如纖連蛋白、轉鐵蛋白、胰島素和表皮生長因子等,不少細胞即能在無血清供應的情況下生長。通過細胞工程方法使細胞高水平表達外源基因并正確加工表達產物,從而提高整個表達系統的產率,也成為應用大規模動物細胞培養生產外源目的蛋白的研究的重要手段。改善細胞環境是當前眾多生物反應器及控制器研究者的不懈努力方向。隨著對細胞生長和產物生成之間相關性研究的深入,對生物反應器更多培養狀態參數的在線檢測以及各種新細胞生物反應器系統的開發利用,新的培養/控制模式將會在現有基礎上不斷產生。
      經過幾十年來的研究與實踐應用,動物細胞培養技術已日趨完善,發展方向將集中在改進細胞特性,優化細胞環境,擴大生產規模和提高目的產物的產率與產量等幾方面:①開發能高密度生長、能分泌大量目標產品的細胞系;②研制細胞生長性能優良、吸附細胞容易、解離細胞容易并能重復使用的新型微載體;③研制規模化生物反應器,實時檢測系統,剪切力小、混臺性能好的新型細胞培養系統和細胞培養與產物分離的耦合系統;④設計新的適合于各個體細胞株(系)的無血清、無蛋白培養基,使生物制品更安全;⑤開展三維細胞培養及組織工程研究。

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